大鼠ELISA試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法。用抗體包被于酶標(biāo)板上，實(shí)驗(yàn)時(shí)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中的抗原會(huì)與包被抗體結(jié)合，游離的成分被洗去。依次加入生物s化物的抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素。抗體與結(jié)合在包被抗體上的抗原結(jié)合、生物s與親和素特異性結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物(TMB)，TMB在辣根過(guò)氧化物酶的催化下呈現(xiàn)藍(lán)色，加終止液后變成黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值，抗原濃度與OD450值之間呈正比，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中指標(biāo)的濃度。
大鼠ELISA試劑盒試驗(yàn)時(shí)老是失敗的幾個(gè)因素分析：
一、低信號(hào)強(qiáng)度
如果ELISA讀數(shù)低于吸光度下限，且目標(biāo)樣本濃度超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，則進(jìn)行分析的樣本濃度可能太低，或者儀器所能分析的樣本檢測(cè)最佳條件可能未被滿足。在這種情況下，樣本所產(chǎn)生的檢測(cè)信號(hào)應(yīng)該需要被級(jí)聯(lián)放大。
解決方案：
1.增加抗體的孵育時(shí)間。如果在室溫下孵育您的抗體2小時(shí)后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不理想，那么可以嘗試在4℃孵育過(guò)夜。如此，可允許抗原抗體大程度上的結(jié)合，并能擴(kuò)大ELISA中的反應(yīng)信號(hào)。
2.增加二抗-酶結(jié)合物的濃度。ELISA中的E代表酶（通常是辣根過(guò)氧化物酶，HRP），它與底物（通常是TMB）反應(yīng)后可產(chǎn)生鮮艷的藍(lán)色。因而，將HRP濃度提高50％或?qū)⑵浼颖?，則會(huì)產(chǎn)生更強(qiáng)的顏色，易于檢測(cè)。
3.充分避光，以保護(hù)TMB基質(zhì)不受光照影響，并確保其能最大限度地發(fā)揮其性能?？紤]到TMB對(duì)光線非常敏感，因而在黑暗中進(jìn)行ELISA平板的顯色反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生更強(qiáng)的信號(hào)。
二、重復(fù)性不好
同一個(gè)樣本間的各個(gè)復(fù)孔的讀數(shù)有顯著性差異。
解決方案：
1.加樣量多少不一，操作時(shí)間長(zhǎng)短不一。重復(fù)同一樣本時(shí)，加樣量與加樣時(shí)間理應(yīng)相同，同時(shí)也應(yīng)注意移液器的校準(zhǔn)。加樣后可輕微晃動(dòng)酶標(biāo)板使反應(yīng)液充分混合。
2.樣本應(yīng)保證一致、無(wú)污染，并應(yīng)該由同一名操作人員進(jìn)行操作。
3.精密度測(cè)定方法不標(biāo)準(zhǔn)，此時(shí)理應(yīng)采用正確的方法進(jìn)行操作。
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更新時(shí)間：2022-11-14
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